第１卷第１期 ２０１１年２月 神经药理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ 、，０１．１Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．２０１１ 几种适合药物筛选的抗氧化实验微孔板 测定方法及其稳定性研究 张丹参 河北北方学院药学系，张家口，０７５０００，中国 【摘要】目的：建立一系列适用于药物筛选的微孔板抗氧化实验方法。方法：采用ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５连续光谱酶 标测试仪，建立抗ＤＰＰＨ氧化活性、清除羟自由基实验方法（邻二氮菲一Ｆｅ 氧化法）、还原能力测定及抗脂质过 氧化微孔板抗氧化实验方法。结果：这四种抗氧化微孑Ｌ板实验方法具有稳定性好，所需试剂种类少、耗材量少， 方法简便及可重复性强等共同特点；相对而言，抗ＤＰＰＨ氧化和还原实验两种实验方法在这几方面更具优势，更 适合于作为抗氧化药物的大规模初筛基础试验方法。结论：这四种微孑Ｌ板抗氧化实验方法，可以广泛应用于药 物筛选，特别是高通量药物筛选研究。 【关键词】抗氧化活性；药物筛选；微孔板定量检测；２，２ 二苯基一１．苦肼基自由基；羟自由基；氧化还原；脂质 过氧化 【中图分类号】Ｒ３２９．２９ 【文献标识码】Ａ 文章编号：２０９５・１３９６（２０１１）０１—００４５—００６ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｂｏｕｔ Ｓｅｖｅｒａｌ Ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｎｔ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｑｕａｎｔｉ－ｉｆｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒ Ｄｒｕｇ－ｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄＴｈｅｉｒＳｔａｂｉｌｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇ ＺＨＡＮＧ Ｄａｎ。ｓｈｅｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｈｅｂｅｉ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｇｊｉａｋｏｕ，０７５０００，Ｃｈｉｎａ 【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｎｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｇｎ ｒｅｆｌｅｃｔｏｓｃｏｐｅ ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ，ｔｈｅ ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｎｔ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｍｏｄｌｅｓ ｏｆ ａｎｔｉ—ＤＰＰＨ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｅｌｉｍｉｎａｔｉ ｏｎ ｈｙｄｒｏｘｙ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ，ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｎｔ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｍｏｄｌｅｓ ｈａｄ ｍｏｒｅ ｃｏｍｍｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｏｏｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｔｈｅ ｆｅｗｅｒ ｒｅａｇｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ，ｓｉｍｐｌｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｅｐ，ｔｈｅ ｇｏｏｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ， ａｎｄ ＳＯ ｏｎ．Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｓｐｅａｋｉｎｇ，ｔｈｅ ｔｗｏ ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｎｔ ｍｏｄｌｅｓ ｏｆ ａｎｔｉ－ＤＰＰＨ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｈａｄ ｍｏｒｅ ａｄｖａｎｔａｇｅ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｍｏｄｌｅｓ，ａｎｄ ｈａｄ ｍｏｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｎｉｔｉａｌｌｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｎｔ ｄｒｕｇ ａｓ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ： Ｔｈｅｓｅ ｆｏｕｒ ｍｏｄｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｎｔ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｙ ｂｅ ｗｉｄｅｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ａｎｔｉ— ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ． 【ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ】ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２，２－ｄｉｐｈｅｎｙｌ一 １－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨ），ｈｙｄｒｏｘｙ ｒｅｅ ｒｆａｄｉｃａｌ，ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ 抗氧化实验方法是神经退行性疾病治疗药物研究 板抗氧化方法较少，这是因为药物筛选，特别是高通量 筛选，样品量大，每一步反应需时较长，很多方法难以 最常用的实验方法 。 。但目前可用于药物筛选的微孔 基金项目：河北省自然基金资助（Ｎｏ．２００９００１０２６） 作者简介：张丹参，女，教授，博士，博士生导师；研究方向：神经药理学；联系电话：８６—３１３—４０２９５５６，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｄａｎｓｈｅｎ２０ｌ１＠１２６．ｃｏｒｎ ・４５・ 第１卷第１期 ２０１１年２月 神经菊理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ 、，０Ｉ．１ Ｎ０．１ Ｆｅｂ．２０ｌ】 达到长时间反应间隔情况下结果稳定可靠 ３，４ 。本研究 ＤＰＰＨ吸光度值，选取线性范围好的ＤＰＰＨ浓度为试验 浓度。 通过对传统试管抗氧化方法进行改良、创新，使用微孔 板与酶标仪相结合，建立抗２，２．二苯基．１ 苦肼基自 由基（２，２－ｄｉｐｈｅｎｙｌ一１一ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ，ＤＰＰＨ）氧化活性、 １．２．１．３ 阳性药物抗ＤＰＰＨ实验稳定性考察取９６孔 细胞培养板，各孑Ｌ分别加入１５０ ｐ，ｍｏｌ・Ｌ 的ＤＰＰＨ溶 液１８０ ｐ．Ｌ，各浓度梯度Ｖｉｔ Ｅ溶液２０ Ｌ，终浓度分别 为３．９￣５００．０ ｍｏ１．Ｌ～，反应总体积２００ ｐ．Ｌ，以溶剂作 对照。加样后，振荡混匀。封板胶封板后，室温下避光 静置。分别在１０－１２０ｍｉｎ时间范围内，于５１７ ｎｍ处测 清除羟自由基、还原能力测定及抗脂质过氧化微孔板 定量检测（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ）法，通过已知抗氧 化有效药物维生素Ｅ（Ｖｉｔａｍｉｎｅ Ｅ，Ｖｉｔ Ｅ）对这四种方法 进行量效、时效稳定性考察，综合评价上述微孔板抗氧 化实验方法，为其在药物筛选方面的应用提供可靠的 定各孔吸光度值（Ａ）。观察Ｖｉｔ Ｅ抗ＤＰＰＨ的时效量效 实验数据。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１试剂 ２，２一二苯基．１．苦肼基自由基（２，２．ｄｉｐｈｅｎｙ１． １一ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ，ＤＰＰＨ），批号￥２６５７７—３ １ ５；维生 素Ｅ（Ｖｉｔａｍｉｎｅ Ｅ，（＋）． ．ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ，Ｖｉｔ Ｅ）； 维生 素Ｃ（Ｖｉｔａｍｉｎｅ Ｃ，Ｌ．ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ，ＶＣ），批号１４０１２． Ａ１０；硫代巴比妥酸（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ，ＴＢＡ），批号 １６２１５７．０１０，均购自Ｓｉｇｍａ公司；二甲基亚砜（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，ＤＭＳＯ），北京益利精细化学品有限公司；邻二 氮菲（１，１０．ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ，１，１０一菲哕啉），３０％过氧化 氢（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ，Ｈ２Ｏ２），购自国药集团化学试剂 有限公司；硫酸亚铁（ｉｒｏｎ（Ⅱ）ｓｕｌｆａｔｅ，ＦｅＳＯ ），三氯化 铁（ｔｒｉｃｈｌｏｒｉｄｅ ｆｅｒｒｉｃ，ＦｅＣ１ ），北京化学试剂公司。 １．１．２仪器 ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５连续光谱酶标测试仪（ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ软件），美国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ公司；Ｃｏｓｔａｒ ９６孔酶标板，美国Ｃｏｍｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ公司；ＤＹ８９．Ｉ型电 动玻璃匀浆机，宁波新芝科器研究所；ＧＳ．１５Ｒ型冷冻离心 机，美国ＢＥＣＫＭＡＮ公司；ＰＵＲＥＬＡＢ ＰＬＵＳ型超级应用 型超纯水器，美国ＰＡＬＬ公司；ＳＨＺ．８８．１型台式水浴恒温 振荡器，江苏太仓市光明实验分析仪器厂。 １．２实验方法 １．２．１抗ＤＰＰＨ氧化活性实验方法 ５，６ １．２．１．１实验原理ＤＰＰＨ是一种比较稳定的脂性自 由基，其Ｎ上有一个游离电子，其乙醇溶液呈紫色，经 全波长扫描在于５１７ ｎｍ处有最大吸收峰。加入抗氧 化剂以后，ＤＰＰＨ捕捉一个电子与游离电子配对，紫色 褪去，变为无色物质，在５１７ ｎｍ处吸收峰消失，其褪色 程度与其接受的电子数成定量关系。据此原理，可测定 样品提供氢原子、清除自由基、抗氧化的能力。 １．２．１．２ ＤＰＰＨ浓度．吸光度稳定性测定取９６孔细 胞培养板，各孑Ｌ分别加入各浓度梯度ＤＰＰＨ溶液２００ Ｌ，于５１７ ｎｍ，测定各孔吸光度值（Ａ）。根据测得的 ・４６・ 变化过程，确定实验的稳定性和最佳实验反应时问。 １．２．１．４计算方法脂性自由基ＤＰＰＨ清除率（％）＝ ｌ（Ａ溶剂一Ａ样品）／Ａ溶剂Ｊ Ｘ １００％ １．２．２清除羟自由基实验方法（邻二氮菲．Ｆｅ 氧化 法）［７，８ １．２．２．１ 实验原理羟自由基（・ＯＨ）是体内最活泼的 活性氧自由基，可以发生电子转移，夺取氢原子和羟基 化反应，造成细胞永久性损伤。邻二氮菲一Ｆｅ 是常用的 氧化还原指示剂，二者结合后经全波长扫描在５ １０ ｎｍ 处有最大吸收峰。当Ｆｅ 过量时，Ｈ ０ ／Ｆｅ 体系通过 Ｆｅｎｔｏｎ反应产生羟自由基，可氧化邻二氮菲一Ｆｅ 为邻 二氮菲．Ｆｅ ，使其在５１０ ｎｍ处最大吸收峰消失。加入 抗氧化剂后可阻止羟自由基的生成。据此原理，可测定 体系中羟自由基的含量，以及抗氧化剂的抗氧化能力。 １．２．２．２邻二氮菲．Ｆｅ 氧化法溶液配制将邻二氮 菲（５ ｍｍｏｌ・Ｌ一）：ＰＢＳ（０．７５ ｍｏｌ・Ｌ～，ｐＨ７．４）：重蒸水： ＦｅＳＯ （７．５ ｍｍｏｌ・Ｌ ）溶液，按３：８：４：２顺序混合，为 测定贮存液。使用时，将贮存液与重蒸水按ｌ：ｌ稀释， 为测定应用液。 １．２．２－３ 阳性药物清除羟自由基实验稳定性考察取 ９６孔细胞培养板，各孑Ｌ加入测定应用液１７０ Ｌ，各浓 度梯度Ｖｉｔ Ｅ溶液２０ ｐ．Ｌ，终浓度分别为３．９￣５００．０ Ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ～，以溶剂作对照，加样振荡混匀后，再加入 １％Ｈ Ｏ 溶液１０ Ｌ（未损伤组加重蒸水），反应总体积 ２００ Ｌ，振荡混匀。封板胶封板，３７℃保温，分别在 １０￣１２０ ｍｉｎ时间范围内，于５１０ ｎｍ测定各孑Ｌ吸光度 值（Ａ）。 １．２．２．４计算方法表观羟自由基清除率 ）＝＝［（Ａ样品一 Ａ损伤）／（Ａ未损一Ａ损伤）ｊ×１００％ １．２＿３ 还原能力测定方法 １．２－３．１ 实验原理Ｆｅ 可被具有还原能力的物质还 原为Ｆｅ ，Ｆｅ 生成量反映还原剂的还原能力大小。邻 二氮菲．Ｆｅ 为紫红色物质，经全波长扫描在５１０ ｎｍ 处有最大吸收峰；而邻二氮菲．Ｆｅ 无色。据此原理，可 测定还原剂的清除自由基还原能力大小。 １．２．３．２还原能力试剂配制将邻二氮菲（２ ｍｍｏｌ・Ｌ ）： 第１卷第１期 ２０１１年２月 神经药理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ 、ｂｌ＿１ＮＯ．１ Ｆｅｂ．２０Ｉ１ ＦｅＣ１ （２ ｍｍｏｌ・Ｌ ）溶液按１：１混合为测定应用液。将 邻二氮菲（２ ｍｍｏｌ・Ｌ一）：ＦｅＳＯ４（２ ｍｍｏｌ・Ｌ ）溶液按１：１ 混合为对照应用液。 １．２．３．３ 阳性药物还原能力实验稳定性考察取９６孔 细胞培养板，各孔加入测定应用液１８０ Ｌ（对照加对 照应用液）；然后加入各浓度梯度Ｖｉｔ Ｅ溶液２０ Ｌ，终 浓度分别为７．８￣５００．０ ｉ￣ｍｏｌ・Ｌ～，反应总体积２００ ｐ．Ｌ， 以溶剂作对照。加样后，振荡混匀，封板胶封板，室温 下静置。分别在１０￣６０ ｒａｉｎ时间点，于５１０ ｉｌｍ测定各 孑Ｌ吸光度值（Ａ）。 １．２－３．４ 计算方法 样品还原能力（％）＝＝［（Ａ样品一Ａ空白）／ （Ａ对照一Ａ空白）ｊ Ｘ １００％。 １．２．４抗脂质过氧化实验方法¨ １．２．４．１实验原理Ｖｉｔ Ｃ．Ｆｅ 在一定条件下，可以反 应生成氧自由基。氧自由基诱导肝微粒体脂质过氧化 生成过氧化脂质（１ｉｐｏｐｅｒｏｘｉｄｅ，ＬＰＯ）。以ＴＢＡ比色法， 经全波长扫描在５３２ ｎｌＴｌ处有最大吸收峰。通过测定 脂质过氧化产物ＭＤＡ的生成，可以反应样品的抗氧化 能力。 １．２．４．２肝匀浆制备取Ｗｉｓｔａｒ大鼠一只，雄性，断 头处死，放血。取肝脏，４℃生理盐水反复冲洗，滤纸 吸干，称重，制成１０％生理盐水肝匀浆。１０ ０００ ｒ・ｍｉｎ～， ４℃，离心２０ ｒａｉｎ。取上清液（含微粒体），４ ｏＣ保存。 １．２．４．３ 阳性药物抗脂质过氧化实验稳定性考察取 ９６孔细胞培养板，各孔加入肝匀浆上清液２０ Ｌ（对照 加生理盐水），各浓度梯度Ｖｉｔ Ｅ ２０ Ｌ（对照加溶剂）， Ｖｉｔ Ｃ ４０ Ｌ，ＦｅＳＯ ４０ Ｌ；振荡混匀后，封板胶封板， ３７℃水浴３０ ｍｉｎ。然后，各孔加入０．６７％ＴＢＡ溶液 ８０ Ｌ，反应总体积２００ Ｌ，振荡混匀后，封板胶封板， ６０ ｃｃ水浴６０ ｒａｉｎ。冷水冷却，于５３２ ｎｍ测定各孔 吸光度值（Ａ）。 １．２．４．４计算方法样品抑制率（％）＝［（Ａ对照一Ａ样品）／ （Ａ对照）Ｊ Ｘ １００％。 １＿３统计学方法 数据资料应用ＳＰＳＳ１ １．０统计 软件，对组间均值差异进行分析，以ｙ－±Ｓ表示，ｔ 检验 ２结果 ２．１抗ＤＰＰＨ氧化活性实验稳定性考察 ２．１．１ ＤＰＰＨ浓度．吸光度关系曲线 ＤＰＰＨ浓度测定结果见Ｆｉｇ．１。结果表明，ＤＰＰＨ 浓度在１５０／ｚｍｏｌ・Ｌ 时，吸光度（Ａ）值范围在１．０左右， 因此选定该浓度进行稳定性考察。 ２．１．２ Ｖｉｔ Ｅ清除ＤＰＰＨ自由基抗氧化方法稳定性 ８ 磊 七 宝 盖 Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｇｍｏｌ・Ｌ ） Ｆｉｇ．１ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ—ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＤＰＰＨ 考察 根据测得的ＤＰＰＨ吸光度值，选取吸光度适中的 ＤＰＰＨ浓度（１５０ ｍｏ卜Ｌ ）为试验浓度，进行已知抗 氧化药物Ｖｉｔ Ｅ抗ＤＰＰＨ氧化实验，结果见Ｆｉｇ．２。 结果表明，在考察的１ ０～１ ２０ ｍｉｎ时间内，随着作 用时间的延长，Ｖｉｔ Ｅ抗ＤＰＰＨ作用逐渐增强，但在 ３．９－３１．２ ｗｍｏｌ・Ｌ一不同浓度范围内，各时间点的药 效变化不明显，６２．５—５Ｏ０．０ ｗｍｏｌ・Ｌ 浓度范围， 随着浓度增加，各时间点的药物作用曲线逐渐分 离，并在５ ００ ｍｏ１．Ｌ 浓度各时间点，量效趋于 平稳。从Ｆｉｇ．２中可以看出，在这些时间点中，３０ ｍｉｎ的量效曲线基本呈斜线上升。实验结果提示， Ｖｉｔ Ｅ抗ＤＰＰＨ实验方法，在观察的１ ２０ ｍｉｎ内，结 果较稳定，而反应时问点在３０ ｍｉｎ时，量效曲线关 系最佳。 Ｓ ０ 鼍 要 薹 量 Ｏ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（￣ｍｏｌ・Ｌ一 ） Ｆｉｇ．２ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｉｎ ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｔｉｍｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｖｉｔ Ｅ ｏｎ ａｎｔｉ—ＤＰＰＨ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ２．１．３ Ｖｉｔ Ｅ清除ＤＰＰＨ自由基抗氧化量效曲线 根据上述实验结果，选定反应时间为３０ ｍｉｎ的Ｖｉｔ Ｅ 量效关系数据，作Ｖｉｔ Ｅ抗ＤＰＰＨ量效关系曲线，结果 见Ｆｉｇ．３。 第１卷第１期 ２０１１年２月 神经药理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ 、，０１．１ Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．２０ｌ１ 焉 苫 ０ 善 ：鲁 皇 Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｉ．ｔｍｏｌ’Ｌ ） Ｆｉｇ．３ Ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｖｉｔ Ｅ ｏｎ ａｎｔｉ—ＤＰＰＨ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ２．２ 清除羟自由基实验方法（邻二氮菲．Ｆｅ 氧化法） 稳定性考察 ２．２．１ Ｖｉｔ Ｅ清除羟自由基实验方法稳定性考察 根据清除自由基实验原理和方法，进行已知抗氧 化药物Ｖｉｔ Ｅ清除羟自由基实验，结果见Ｆｉｇ．４。结 果表明，ＶｉｔＥ ７．８￣５００．０｝￣ｍｏｌ・Ｌ 浓度范围，在考察的 １０～１２０ ｒａｉｎ时间内，作用时间过长（＞４０ ｒａｉｎ）或过短 （＜３０ ｍｉｎ），其清除自由基作用效果相对较差，而在３０￣４０ ｍｉｎ 时间范围内，各浓度Ｖｉｔ Ｅ清除自由基作用量效曲线基本呈 斜线上升。实验结果提示，Ｖｉｔ Ｅ清除自由基实验，反应时 间点在３０－４０ ａｒｉｎ时，量效曲线关系最佳。 墓 口 ．宝 莹 鲁 Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（￣ｔｍｏｌ・Ｌ一 ） Ｆｉｇ．４ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｉｎ ｄｏｓｅ—ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｔｉｍｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｖｉｔ Ｅ ｏｎ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ２．２．２ Ｖｉｔ Ｅ清除羟自由基量效曲线 根据实验结果，选定３０ ｒａｉｎ的量效关系数据，作 Ｖｉｔ Ｅ清除羟自由基量效关系曲线，结果见Ｆｉｇ．５。 ２．３还原能力测定方法稳定性考察 ２－３．１ Ｖｉｔ Ｅ还原能力测定方法稳定性考察 根据还原能力测定原理和方法，进行已知抗氧化 药物Ｖｉｔ Ｅ还原能力测定，结果见Ｆｉｇ．６。结果表明，在 考察的１０￣６０ ｒａｉｎ内，７．８￣５００．０ ｔｏｏｌ・Ｌ 随着作用 时间的延长，各浓度Ｖｉｔ Ｅ的还原能力逐渐增强，除 ・４８・ ： ０ 毫 兽 暑 Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｉｘｍｏｌ。Ｌ ） Ｆｉｇ．５ Ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｖｉｔ Ｅ ｏｎ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ １００ ｏ召ＢＪ营Ｄｌ 占 ＨＩⅡＨ ∞ ∞ 加 Ｏ ７．８ ｌ５．６ ３１．２ ６２．５ １２５．０ ２５０．０ ５００．０ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｇｍｏｌ・Ｌ一 ） Ｆｉｇ．６ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｉｎ ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｔｉｍｅ—ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｖｉｔ Ｅ ｏｎ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ １０ ｒａｉｎ作用时间点外，其余各时间点、各浓度Ｖｉｔ Ｅ药 效基本接近，还原作用量效曲线基本呈斜线上升。实验 结果提示，Ｖｉｔ Ｅ还原实验，反应时间点在２０￣６０ ｒａｉｎ时， 量效曲线关系最佳。 ２．３．２ Ｖｉｔ Ｅ还原实验量效曲线 根据实验结果，选定３０ ｒａｉｎ的量效关系数据，作 Ｖｉｔ Ｅ还原能力的量效关系曲线，结果见Ｆｉｇ．７。 Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（１￣ｍｏｌ‘Ｌ ） Ｆｉｇ．７ Ｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｖｉｔ Ｅ ｏｎ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ∞ 第１卷第１期 ２０１１年２月 神经药理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｖｂ１．１ Ｎｏ．１ Ｆｅｂ．２０ｌ１ ２．４ Ｖｉｔ Ｅ抗脂质过氧化实验方法稳定性考察 稳定性考察，同时进行多靶点、长时程的药效学研究， 根据抗脂质过氧化实验测定原理和方法，进行已 知抗氧化药物Ｖｉｔ Ｅ抗脂质过氧化能力测定，结果见 Ｆｉｇ．８。结果表明，Ｖｉｔ Ｅ随着浓度的增加，抗脂质过氧 为药物筛选、特别是高通量药物筛选，建立了稳定、灵 敏、特异的系列抗氧化作用筛选方法。 在大规模药物筛选实验中，由于耗时较长，实验条 件在长时间范围内的稳定性显得尤为重要¨ 。相应方 法学稳定性考察研究发现，这四种抗氧化微孑Ｌ板实验 方法的共同优势：①较长的时间内相对稳定，适合大 批量药物的仪器筛选；②耗材量少，试剂量以微升计； 化作用逐渐增强，在０．０３１￣０．５００ ｍｏｌ・Ｌ 浓度范围 内，量效曲线关系最佳。研究结果证实，微孔板法抗脂 质过氧化试验方法可行。 ③试剂种类少，部分试剂配制可交互使用；④方法简 ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｇｍｏｌ・Ｌ－１） Ｆｉｇ．８ Ｄｏｓｅ—ｅｆｆｅｃｔ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｖｉｔ Ｅ ｏｎ ａｎｔｉ－ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ３讨论 自由基是人体进行生命活动时所产生的一种活性 分子。自由基对人体具有一定的生理作用，但是体内自 由基过多，就可导致细胞和组织器官损伤、诱发各种疾 病、加速机体衰老。因此，为了减轻自由基的危害、提高 人群的生活质量，寻找高效、价廉、低毒的阻断自由基 反应的抗氧化剂的筛选研究方法显得尤为重要川 。抗 氧化剂的抗氧化作用可以通过抑制自由基的产生，或 直接清除自由基，甚至可以通过提高内源性抗氧化物 质的水平来实现¨ 。 ＤＰＰＨ法于１９５８年被提出，广泛用于定量测定 生物试样、各类物质和食品的抗氧化能力¨ Ｈ 。清除 ＤＰＰＨ法的优点是快速，易重复，简单，灵敏，不需要复 杂的仪器，所以在生产活动中大规模应用¨ 。 抗氧化实验方法是抗衰老药物和治疗神经退行性 疾病药物的筛选或高通量药物筛选最常用的初筛实验 方法¨ 。众多的抗氧化实验方法，多见于试管实验。 试管实验简单易行，但有其局限性 Ｊ：试剂量是以毫升 计，实验材料耗费量大 ；受实验条件所限，无法同时 进行大批量药物筛选或高通量药物筛选 。本研究 优化选择相对稳定的抗ＤＰＰＨ氧化活性、清除羟自由 基实验方法（邻二氮菲．Ｆｅ。 氧化法）、还原能力测定及 抗脂质过氧化实验方法，进行改良与创新，并选用已知 稳定的抗氧化有效药物Ｖｉｔ Ｅ进行方法学的量效、时效 便，药物经过这四种抗氧化实验连续筛选，需时约３天 即可完成；⑤可重复性强，可以广泛应用于药物筛选， 特别是高通量药物筛选研究。 这四种抗氧化实验方法相比较而言，本研究优化 完善的抗ＤＰＰＨ氧化和还原实验，较其他两种抗氧化 实验方法稳定性好，周期短，重现性好；特别是还原实 验，本研究观察时间至７２ ｈ，实验结果基本无变化，更 适合于作为抗氧化药物的大规模初筛基础试验方法。 而抗脂质过氧化实验方法，需要的实验条件相对较高： ①必须是恒温水浴时间足够，本研究曾采用恒温箱温 育，结果不理想；②微孑Ｌ板实验必须是大鼠肝脏，本研 究也曾考察选用小鼠肝脏实验，结果也不理想。这些试 验结果不理想的原因，仍有待进一步考察。 参考文献 １ 张丹参，张力，薛贵平，等．大黄酚的抗衰老作用【Ｊ］＿中国 医院药学杂志，２００５，２５（１）：１５—１７ ２ 王树，张丹参，薛贵平，等．大黄酚对脑缺血再灌注小鼠脑 组织Ｈ Ｏ：和ＣＡＴ的影响影响［Ｊ］．中药药理与临床，２００８， ２４（４１：２２—２３ ３ 李秋红，李延利，黄莉莉，等．中药抗氧化的作用机理及评价 方法研究进展［Ｊ］＿时珍国医国药，２００８，１９（５）：１２５７—１２５８ ４ 梁云，王洪新．几种天然抗氧化剂清除自由基能力的比较研 究［Ｊ］．安徽农业科学，２００８，３６（６）：２１８１—２１８３ ５ 张丹参，张天泰，杜冠华．均匀设计．高通量筛选技术在中 药丹参多成分配比研究中的应用【Ｊ］．中国药学杂志，２００９， ４４（１４）：１０４８一ｌ０５２ ６ Ｓｈｅｎｇ Ｚｈａｎｗｕ，Ｍａ Ｗｅｉｈｏｎｇ，Ｇａｏ Ｊｉｎｈｅ，ｅｔ ａ１．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｂａｎａｎａ ｌｆｏｗｅｒ ｏｆ ｔｗｏ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｕｓｉｎｇ ２， ２－ｄｉｐｈｅｎｙｌ—ｌ—ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ（ＤＰＰＨ）ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｗｅｒ，２，２’－ ａｚｉｎｏｂｉｓ一（３－ｅｔｈｙ１ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６一ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ（ＡＢＴＳ）ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ［Ｊ］．Ａｆｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２０１１，ｌ０（２１）：４４７０—４４７７ ７ 徐向荣，王文华，李华斌．比色法测定Ｆｅｎｔｏｎ反应产生的 羟自由基及其应用【Ｊ］＋生物化学和生物物理进展，ｌ９９９，１ （１）：６７—６９ ・４９・ 第１卷第１期 ２０１１年２月 神经药理学报 Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｖ １．１ＮＯ．１ Ｆｅｂ．２０１１ Ｈａｒａｓｉｔ Ｋｕｍａｒ Ｍａｎｄａｌ，Ｔａｐａｓ Ｍａｊｕｍｄａｒ，Ａｍｂｉｋｅｓｈ Ｍａｈａｐａｔｒａ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｓ（１，１ ０一 食品工业科技，２００９，３０（４）：３３５．３３９ １２宋怀恩，闻韧．抗氧化剂筛选方法的研究进展［Ｊ］．中国药物 化学杂志，２００３，１３（２）：ｌ１９．１２３ １３ Ｇｒａｈａｍ ｗ＿Ｂｕｒｔｏｎ．Ｍａｒｅｔ Ｇ．Ｔｒａｂｅｒ．Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ：Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｈｅｎｅｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）Ｆｅ（Ⅱ）：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒ—ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｓｐｅｃｔｓ，２０１ １，３８０（１－３）：３００—３０７ ９ Ｍａｓｏｏｄ Ａｈｍａｄ Ｒｉｚｖｉ，Ｒａａｓｈｉｄ Ｍａｑｓｏｏｄ Ｓｙｅｄ，Ｂａｄｒｕｄｄｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｂｉｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｂｉｏａＶａｉｌａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ， １９９０，１０：３５７—３８２ １４ Ｖ．Ｂｏｎｄｅｔ，Ｗ．Ｂｒａｎｄ—Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｂｅｒｓｅｔ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＤＰＰＨ ｆｒｅｅ ｒａｄｉ— Ｋｈａｎ．Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｒｅｄｏｘ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）－ Ｉｒｏｎ（Ⅱ）ｃｏｕｐｌｅ：ａ ｓｉｍｐｌｅ ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｊ． Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ，２０ １ １，８８（２）：２２０—２２２ Ｆａｔｍａ Ｍ，Ｅｌ—Ｄｅｍｅｒｄａｓｈ．Ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ，ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．ＬＷＴ－Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ—Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ．１９９７．３０ ｆ６）：６０９－６１ ５ ａｎｄ ａｃｅｔｙｌｃｈｏＩｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ ｉｎ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓ— １５ Ｏｍ Ｐ．Ｓｈａｒｍａ，Ｔｅｊ Ｋ．Ｂｈａｔ．ＤＰＰＨ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｓｓａｙ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００９，１ １３（４）：１２０２—１２０５ ｐｈａｔｅ ａｎｄ ｐｙｒｅｔｈｒｏｉｄ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ ｃｈｅｍ Ｔｏｘｉｃａｌ， ２０ｌｌ，４９（６）：ｌ３４６—１３５２ ｌ６梁云，王洪新．几种天然抗氧化剂清除自由基能力的比较研 究［Ｊ］＿安徽农业科学，２００８，３６（６）：２１８ｌ一２１８ 罗成，周达，鲁晓翔．天然产物抗氧化机理的研究进展［Ｊ］． 、 》、：２ 驴护驴驴 驴驴驴、 ２ 、： ・５０・